Giuseppe di Stefano se původně měl stát knězem a vzdělání získal v jezuitském semináři svatého Avalda v Miláně. Jeho krásný hlas však budil tolik nadšení, že se rozhodl navštěvovat hodiny zpěvu. Zpočátku zpíval ve dvou chlapeckých sborech v Miláně, Santa Maria Di Caravaggio a Duomo. V roce 1938 zvítězil na dvou pěveckých soutěžích – v Miláně a ve Florencii. Zpíval také po různých kavárnách a kinech a jeho repertoár sahal od operních árií po neapolské písně a nejnovější taneční hity. Dva roky (1938-40) pak strávil pod vedením Adriana Tocchia v La Scale, kde také zpíval jako tenor ve sboru.
V roce 1940 se stal žákem barytonisty Luigiho Montesanta, ale jeho studia přerušila 2. světová válka. V lednu 1941 byl povolán do armády, kvůli dýchacím potížím byl ovšem zproštěn aktivní vojenské služby. Místo toho zpíval pod pseudonymem Nino Florio ve vojenských táborech i mimo ně a stal se tak poměrně známým. Když v roce 1943 po zatčení Benita Mussoliniho jeho vlastní vládou německá vojska obsadila Lombardii, odešel ze země do Švýcarska. Zde zpíval v uprchlických táborech a v letech 1944 a 1945 vystupoval v Lausanne v Radio Suisse Romande, zde také nahrál úryvky z oper L’elisir d’amore a Il tabarro.
V roce 1945 se vrátil do Milána a znovu začal studovat u Montesanta, který se později stal také jeho manažerem. V dubnu 1946 debutoval jako Des Grieux v Massenetově Manon. Brzy se stal známým po celé Itálii a v průběhu roku 1946 vystupoval v Benátkách (Les Pêcheurs de Perles), Janově (Rigoletto), Lugu (L’Amico Fritz, Rigoletto, La Traviata), Bologni (La Sonnambula) Piacenze (Manon) Ravenně (Manon, La traviata) a Ceseně (Manon).
V roce 1948 debutoval v Metropolitní opeře jako vévoda v Rigolettovi a následně se objevil jako Des Grieux v Manon. V následující sezoně 1948/49 a účinkoval v Mignon, Traviatě, L’elisir d’amore, Gianni Schicchi (Rinuccio), Falstaffovi (Fenton), Bohémě a Mefistovi (Faust). V téže sezóně zpíval také v Baltimoru, Bostonu, Miami, Dallasu, Los Angeles, Salt Lake City, Detroitu, Pittsburghu a Clevelandu. V roce 1952 však vedly neshody s MET k jeho odchodu. Přesto se do Metropolitní opery v New Yorku vrátil ještě pětkrát, a to v představeních Carmen (1955), Rigoletto, Tosca a Faust (1956) a Les Contes d’Hoffman (1965).
V roce 1951 slavil v brazilském Theatro Municipal v São Paulu velkolepý úspěch s Marií Callasovou a Titem Gobbim v Traviatě. Následující rok opět uspěl v Palacio de Bellas Artes v Mexico City, kdy zpíval opět s Callasovou v I puritani. O Vánocích 1952 se znovu setkali v Miláně při představení La Giaconda v La Scale.
Velkým okamžikem v jeho kariéře byla inscenace Lucie z Lammermooru s dirigentem Herbertem von Karajanem v La Scale v lednu 1954. V Miláně vznikla slavná nahrávka Tosky pro EMI pod taktovkou Victora de Sabaty.
V roce 1955 si jej Herbert Von Karajan vybral pro svou Carmen v La Scale. Poté měl účinkovat v Traviatě Luchini Viscontiho, který zbožňoval Marii Callasovou (byla podle něj zosobněním ideální tragické hrdinky) a vybral si ji pro roli Violetty. Di Stefano považoval mediální rozruch kolem Callasové za přílišný a po premiéře inscenaci na protest opustil.
S Callasovou se nicméně setkal ještě v téže sezóně při nahrávání Rigoletta (EMI) pod vedením Tullia Serafina s Gobbim v titulní roli. Prakticky ve stejné době nahrál Traviatu s Antoniettou Stellou a Gobbim (rovněž EMI). Krátce poté odcestoval s La Scalou do Berlína s Lucií z Lamermooru pod vedením von Karajana, kde jej kvůli potížím musel v závěrečné scéně nahradit Giuseppe Zampieri. V témže roce se poprvé po třech letech opět objevil v MET v Carmen s Risë Stevensovou, následoval Faust s Dorothy Kirstenovou a Jeromem Hinesem.
Rok 1956 byl pro di Stefana ve znamení změny repertoáru – začal se přiklánět ke spinto rolím. Tuto změnu předznamenala Carmen v Miláně a New Yorku (1955), poté těžší role jako Cavalleria Rusticana, a La forza del destino, obě v Teatro Massimo v Palermu pod Serafinovou taktovkou, Pagliacci v Miláně pod taktovkou Nina Sanzogna, La Gioconda v Aréně di Verona pod vedením Votta, Il trovatore v Miláně s Callasovou pod vedením von Karajana, Aida se Stellou pod Vottovým vedením v prosinci, a nakonec Mascagniho Iris. V této době také slavil jeden ze svých největších úspěchů, když ho von Karajan pozval do vídeňské Státní opery, aby účinkoval v Lucii.
Ač se Giuseppe di Stefano stal během krátké doby předním světovým lyrickým tenorem, jeho kariéra často trpěla kvůli řadě impulzních rozhodnutí. Roztržka v MET v roce 1952 byla jedním z takových příkladů, spor s Viscontim v La Scale v roce 1955 dalším. Za třetí lze považovat změnu repertoáru směrem ke spinto rozsahu. Jeho hlas se nehodil pro těžší role a už vůbec ne pro způsob, jakým jej využíval. Zpíval s otevřeným a nekrytým tónem, „voce aperta“, jak to nazval Giacomo Lauri-Volpi, a se zneužíváním „note spalancate“ riskoval předčasné rozuzlení. První příznaky astmatu se začaly projevovat koncem padesátých let a nemoc se stala komplikací pro zbytek jeho kariéry.
Ač se nadále objevoval ve spinto rolích, k lyrickému repertoáru se vrátil v L’elisir d’amore v Edinburghu a v La bohème v Mexico City. V roce 1958 doplnil svůj repertoár o Turandot se Serafinem v Chicagu a v 1959 o Andreu Chénier v Římě. V roce 1961 hrál ve světové premiéře Ildebranda Pizzettiho Il calzare d’argento v La Scale. Navzdory chabému zdraví a hlasovým potížím si na premiéře vedl dobře, což se již nedalo říci o představení Tosky v Covent Garden v témže roce, kdy jej publikum nepřijalo. Do Covent Garden se vrátil v roce 1963 s operou La bohème, ale představení musel zrušit kvůli vážným problémům s hlasem. Nahradil jej tehdy neznámý Luciano Pavarotti.
V polovině šedesátých let Di Stefano stále méně vystupoval v operách a omezil se na koncerty a recitály. Jeho potíže se stupňovaly a v roce 1965 vedení Teatro Colón raději rozvázalo s di Stefanem smlouvu a zrušilo všechna představení. V roce 1966 se po boku Tita Gobbiho pokusil o roli Othella, ovšem opět bez úspěchu.
V letech 1964 a 1965 často zpíval ve Vídni, v roce 1967 slavil úspěch v Monteverdiho Korunovaci Poppey. V roce 1967 podnikl velké turné, na němž vystupoval s Lehárovou operetou Das Land des Lächelns. Jeho operní účinkování se omezilo na několik inscenací ročně až do roku 1973, kdy zpíval I vespri siciliani v Turíně. Poté přestal vystupovat v operních dílech úplně, ale přesto zpíval po celá sedmdesátá a osmdesátá léta v různých recitálech. V roce 1973 doprovázel Marii Callasovou na jejím posledním recitálovém turné.
Naposledy vystoupil v červnu 1992, kdy ve věku 71 let zpíval roli císaře v Turandot v římském Caracallově divadle. V listopadu 2004 byl Giuseppe Di Stefano ve svém domě v keňském Diani Beach brutálně napaden a ze zranění, která mu útočníci způsobili, se již nikdy plně nezotavil. Zemřel 3. března 2008 ve svém domě v Santa Maria Hoè severně od Milána.
